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细菌16S鉴定序列为什么会有简并碱基呢?

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微生物资源是生物技术创新的重要源泉,其多样性的研究有利于微生物资源的充分挖掘与利用,其中细菌菌种鉴定是微生物领域的重要工作。近年来,分子生物学技术的飞速发展为快速鉴定细菌提供了技术支撑,16S rRNA基因已经被广泛用于细菌生物学分类及系统发育研究,但在测16S rRNA基因时,常常遇到一个问题,Sanger测序出来的16S序列碱基常常存在简并碱基,明明是纯菌落,鉴定序列为什么会有简并碱基呢?


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众所周知,Sanger测序是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每一个碱基后面进行荧光标记,产生以ATCG结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳检测,每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离,制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。DNA复制不同的是sanger测序中的引物是单引物或者是单链。


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一代测序仪会生成四色色谱图,显示测序运行的结果以及计算机程序对数据的最佳猜测,同一轨迹内的一个单峰位置可能有两个不同颜色的峰,而不是一个(如图1),当PCR产物来自二倍体基因组DNA时,多态位置将同时显示两个核苷酸,具有明显的杂合单核苷酸多态性(SNP)。在这种情况下,一个等位基因携带一个A,而另一个携带一个G。两个峰值都存在。在利用16S rRNA基因鉴定细菌过程中,也会有这种类似SNP的现象出现,这是什么原因造成的呢?这就需要我们先来讲一讲细菌中16S拷贝数的问题。

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图1  Sanger sequencing测序原理图(图片来自网络)


细菌拥有70S核糖体,由大亚基(50S)和小亚基(30S)组成;小亚基包括16S rRNA和约21个蛋白,大亚基包括5S rRNA,23S rRNA和约33个蛋白(图2)。16S rRNA是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分,16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列,普遍存在于细菌和古细菌中,全长1500bp左右,其结构由9个可变区(variableregion)和10个保守区(conservedregion)交替组成(图3)。保守区有利于扩增引物的设计,可变区体现了物种间的进化差异。这些特性使16S rRNA基因成为原核生物鉴定分类、系统进化以及多样性分析等研究中常用的分子标志物。


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图2 原核生物核糖体图


16S rRNA基因常用于原核生物种属的分类及鉴定。但16S rRNA基因在细菌中为多拷贝基因,因菌株而异,有一些菌株基因组里16S rRNA基因各拷贝序列完全相同,但也有一些完全不同,甚至也可以有几个相同,有几个不同。例如,耶尔森菌(Yersinia spp.)核糖体基因的拷贝数是7个左右,目前NCBI数据库中耶尔森菌全基因组测序株染色体中16S rRNA基因多拷贝间存在基因差异的拷贝数大部分在3个以内,有研究对每个菌株随机挑选5个16S rRNA基因克隆子进行测序分析,结果表明60%的菌株包含2-3种16S rRNA基因类型,18%菌株包括4个类型,仅有17%的菌株只有1种16S rRNA类型。有文献报道,这种异质性与环境的适应性有关。例如,创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的16S rRNA基因可分成A、B两种类型。B类型与临床菌株相关,而A与环境菌株相关。
在细菌染色体上,物种RNA(16S、23S和5S)基因成簇存在,形成一个操纵子且在基因组中有多个拷贝。随着测序技术发展,大量的细菌全基因组被解析,为16S rRNA基因不同拷贝的异质性研究提供了便利。
例如,Schirrmeister 等人发现,蓝细菌细胞内16S的拷贝数的增加与其末端分化相关,蓝细菌门细胞内16S的拷贝数变异(1 ~ 4个)和各拷贝间的异化度也明显低于其他门(绿细菌门、螺旋体门和拟杆菌门);Nanamiya 证实含有单个rRNA操纵子拷贝的缺失突变体,其生长明显变慢,产芽胞率降低1至4个数量级。但总体上讲,原核生物16S拷贝数及其异化的研究对于避免菌种鉴定错误、纠正对原核生物丰度和多样性的高估也具有重要意义。


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图3 16S rRNA基因结构与引物示意图


测序出现了多个颜色的峰,为了方便记录,我们通常会用一个符号代替某两个或者更多碱基,我们称之为简并碱基。以下就是简并碱基符号对应表:


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所以当我们鉴定报告中序列组成出现除了ATCG以外的字母,你知道代表了什么了吗?
小编期望通过这期的推文,为大家解答一下16S鉴定序列为什么会有简并碱基的问题,欢迎大家来评论区中讨论啊。

参考文献


  1.  黄志强,邱景璇,李杰,许东坡,刘箐.基于16S rRNA基因测序分析微生物群落多样性[J].微生物学报,2021,61(5):1044-1063.

  2. 郝慧静.利用染色体基因组上多拷贝16S rRNA基因鉴定耶尔森菌属细菌的研究[D].中国疾病预防控制中心,2016.

  3. 阎永伟,张德民.原核生物16S rRNA基因多重拷贝及其序列异化[J].生物学杂志, 2013, 30(4):4.

  4. Pei AY, Oberdorf WE, Nossa CW, Agarwal A, Chokshi P, Gerz EA, Jin Z, Lee P, Yang L, Poles M, Brown SM, Sotero S, Desantis T, Brodie E, Nelson K, Pei Z. Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes. Appl Environ Microbiol. 2010 Jun;76(12):3886-97. doi: 10.1128/AEM.02953-09.

  5.  Coenye T, Vandamme P. Intragenomic heterogeneity between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes. FEMS Microbiol Lett. 2003 Nov 7;228(1):45-9. doi: 10.1016/S0378-1097(03)00717-1. 

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