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基于新靶基因的葡萄球菌快速检测与定量方法

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大家好!小编今天给大家分享一篇科研文章题为《Real-Time PCR Method for the Rapid Detection and Quantification of Pathogenic Staphylococcus Species Based on Novel Molecular Target Genes》。篇文章主要介绍了一种快速、准确的检测技术,可以检测食品中的四种葡萄球菌种类。接下来,小编将为大家简要介绍文章的主要内容。

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01. 研究背景 AUTUMN

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葡萄球菌(Staphylococci)是一种常见的病原菌,广泛分布于自然界,并经常从食品中分离出来。其中,金黄色葡萄球菌(S. aureus)是最重要的食源性病原菌之一,产生的葡萄球菌肠毒素可引起腹泻和呕吐,直接侵袭或通过系统传播对人体健康产生不利影响。与食源性病原葡萄球菌不同,表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、头葡萄球菌(S. capitis)和山羊葡萄球菌(S. caprae)都是凝集酶阴性的葡萄球菌(CoNS)。传统上,这些葡萄球菌被认为是共生菌,但现在被认为是机会性病原菌。此外,这些葡萄球菌种类也会污染食品,成为即食食品中突出的致病菌株。因此,需要准确的方法来检测和区分食品中的葡萄球菌种类,以减少疾病爆发并确保食品安全。

传统的检测病原菌的方法需要多个步骤,包括预富集、选择性培养和选择性平板培养,然后通过分析其他生化试验进行表征。这个过程工作量大、耗时长,不经济,也无法检测到存活但无法培养的细胞现有的葡萄球菌检测方法有表型和基因型两种。根据表型特性进行检测的方法有Staph-Zym试验、API Staph试验和BF Phenix自动微生物学系统等。近年来还有使用基于蛋白质谱的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法来检测葡萄球菌。然而,API试剂盒的生化反应准确性较低(50-70%),自动质谱系统的高初始采购成本限制了它们的应用。与基因型检测方法相比,表型测试的准确性较低。

近几十年来,分子检测方法如PCR已广泛应用于病原菌的检测,因为它们比传统培养方法更快速、简单。其中,实时PCR由于其高灵敏度和高效性等优势,已成为与食品相关的细菌种类检测和定量的有用工具。目前,实时PCR被用于监测食品加工过程中的葡萄球菌。选择适当的基因或序列对于使用PCR检测病原菌至关重要。以往使用的分子靶基因包括16S rRNA基因、tuf基因和nuc基因等。然而,这些基因在不同的葡萄球菌种类中存在一定的保守性,不能完全区分不同的种类。

02.泛基因组分析 AUTUMN

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对上述4个物种的155个金黄色葡萄球菌基因组进行泛基因组分析,以筛选出用于检测四种金黄色葡萄球菌物种的靶基因。通过分析,得到了一个由9461个基因组成的泛基因组,其中包括464个核心基因、6772个附属基因和2225个独特基因。在6772个附属基因中,有4个基因在35个金黄色葡萄球菌基因组中普遍存在,有13个基因在16个S. capitis基因组中普遍存在,有15个基因在15个S. caprae基因组中普遍存在,有18个基因在28个S. epidermidis基因组中普遍存在。通过blast程序,将54个候选基因与NT库进行了比对。根据靶基因在所有目标物种基因组中的100%存在以及在非目标金黄色葡萄球菌基因组中的缺失,筛选出了用于检测金黄色葡萄球菌物种的分子靶基因。这些分子靶基因的功能如下GntR家族转录调节因子(用于金黄色葡萄球菌)、FAD依赖性尿酸羟化酶(用于头葡萄球菌)和革兰氏阳性信号肽蛋白(用于山羊葡萄球菌)、磷酸甘露醇异构酶(用于表皮葡萄球菌)。

03.引物设计和特异性、灵敏度评估 AUTUMN

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根据泛基因组筛选到的目标基因,设计引物用于实时聚合酶链式反应(PCR)。引物设计借助计算机软件(如Primer3)进行,主要依据包括引物的长度、GC含量、特异性等因素,引物信息如下图所示。

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选取了12个目标葡萄球菌菌株,27个非目标葡萄球菌菌株,73个非葡萄球菌菌株进行实时PCR的特异性验证,目标菌株均能检测到扩增信号,非目标菌株均没有扩增信号。

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对目标葡萄球菌菌株采用102–108 CFU/mL梯度进行实验,S. aureus,S. capitis,S. caprae,S. epidermidis的灵敏度检测结果分别为1.5x102 CFU/mL,2.6x102 CFU/mL,1.4x102 CFU/mL,和1.09x102 CFU/mL。

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04.人工污染食品样品中葡萄球菌的检测 AUTUMN

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由于食物基质中DNA浓度可能被低估,可能会影响实时PCR的效率。本研究采用人工向牛奶中添加四种葡萄球菌,对食品基质进行定量分析。同时,将牛奶样品接种四种致病性葡萄球菌,以诱导菌株之间对相同营养物质的竞争。人工接种葡萄球菌的Ct值(平均Ct值:14.11–33.27)与纯培养细菌相似(平均Ct值:13.7–33.82)。四个物种的标准曲线R2均大于0.999,S. aureusS. capitisS. capraeS. epidermidis的灵敏度检测结果分别为1.5x102 CFU/mL,2.6x102 CFU/mL,1.4x102 CFU/mL和1.2x102 CFU/mL。这些结果表明,实时荧光定量PCR方法可以检测到4个葡萄球菌,不受食物基质影响。

05.食品中分离菌株的实时PCR检测 AUTUMN

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从鸡、牛肉、猪肉、鱼、咸鱼和生奶中共分离到103株菌株。所有菌株均有一条扩增曲线,结果可见下表。

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06.比较不同食品样品中目标葡萄球菌的存在情况 AUTUMN

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对检测到目标葡萄球菌的食品样品进行分类和统计分析,比较不同食品样品中目标葡萄球菌的存在情况。采用本研究开发的实时荧光定量PCR方法对50个样品进行了检测。在猪肉和生奶中检测到11次金黄色葡萄球菌,在生奶中检测到9次表皮葡萄球菌。在发酵鱼和生奶样品中检测3次到头葡萄球菌。山羊葡萄球菌不存在于任何食物样本中。结果显示,金黄色葡萄球菌检出率为22%,头葡萄球菌检出率6%,表皮葡萄球菌检出率18%。这些结果与之前的研究结果一致,即表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌是污染食物的主要葡萄球菌种类。

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总    结

该研究主要介绍了一种基于新型分子靶基因的检测方法,用于快速、准确地检测四种致病性S. aureusS. epidermidisS. capitisS. caprae已知的一些靶标基因 16S rRNA gene, tuf (elongation factor Tu), sodA (superoxide dismutase A),nuc (thermostable nuclease)和dnaJ (chaperone dnaJ)不能特异性的检测这4种致病性葡萄球菌。本文利用泛基因组分析筛选到4个可靠的靶标基因,由此设计出相应的具有高特异性和高灵敏度的引物探针,可用于特异性的检测四种致病性葡萄球菌。

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参考文献

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Kim, E.; Yang, S.-M.; Won, J.-E.; Kim, D.-Y.; Kim, D.-S.; Kim, H.-Y. Real-Time PCR Method for the Rapid Detection and Quantification of Pathogenic Staphylococcus Species Based on Novel Molecular Target Genes. Foods 2021, 10, 2839. https://doi.org/10.3390/foods10112839

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