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药品微生物学中培养基的评估

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对于大多数微生物试验来说,培养基都是至关重要的,没有高质量的培养基,可能会降低微生物试验结果的准确性、重复性和再现性。

微生物培养基是一种促进微生物生长和繁殖的物质,通常含有营养素、促生长因子、能量来源、缓冲盐、矿物质、金属离子和凝固剂(用于固体培养基)。自19世纪以来,微生物学家一直在使用培养基。即使现在微生物快速检测方法越来越多,制药工业的QC实验室中,大多数微生物试验方法也需要使用到培养基。本文阐述了在设计一个合适的微生物培养基质量控制和放行的体系时需要考虑的一些因素。

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培养基类型


根据培养基配方的变化,有一系列的培养基可供选择。通常,我们根据培养基的物理状态将培养基分为:

液体培养基,通常称为“肉汤”(broth)。

固体和半固体培养基,通常称为”琼脂”(agar)。

此外,根据培养基的预期用途不同,可进一步分为促生长培养基(设计用于培养大多数异养微生物)、运输培养基(用于保存微生物)、富集培养基(旨在增加所需微生物数量的培养基)和选择性生长培养基等。

药品微生物学实验室根据需求选择和使用这一系列的培养基。两种最常见的通用型培养基是营养琼脂/肉汤,以及胰蛋白酶大豆琼脂/肉汤(TSA/TSB)等。尤其是TSA广泛用于环境监测。该培养基用于分离和培养对生长条件非挑剔和挑剔的微生物。TSB用于无菌试验,或在微生物计数试验中作为一般生长肉汤,以及用于培养基模拟灌装试验。在一些培养基灌装试验中,植物蛋白胨肉汤(Vegetable Peptone Broth)被用作TSB的替代品,因为它不含动物源性成分。

其他常用的培养基包括硫乙醇酸盐流体培养基(FTM),用于细菌(需氧和厌氧)的培养,作为无菌试验的一部分。如果需要对真菌进行监测,例如在环境监测中,通常使用的培养基是沙氏葡萄糖琼脂(SDA)或麦芽提取物琼脂(MEA);对于水系统微生物的试验,使用R2A,这是一种用于培养异养微生物的低营养琼脂。还有一些培养基用于微生物的鉴定,如哥伦比亚血琼脂(用于检测葡萄球菌的溶血反应)。

培养基的配制可以在实验室内部完成(使用脱水配方),或者是购买成品培养基的。如果购买成品培养基,则有责任对培养基的制造商进行审查。对于某些平皿培养基,如洁净室中使用平皿培养基,应进行辐照灭菌。

培养基的质量控制


每一批次的培养基在投入正常使用前都需要进行某种形式的质控测试,以提供使用该批次培养基进行试验时,试验结果准确性的置信度。测试通常在所有准备步骤(包括辐照灭菌)完成后进行。


培养基的质量控制可分为两部分:

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1.理化特性

根据培养基的类型不同,对培养基的理化特性进行的测试有所不同。对于理化特性的测试包括但不限于:

①颜色目视检测:应将灭菌培养基的颜色与未灭菌培养基进行比较,并记录颜色差异。

②澄清度目视检测:应检查培养基的清澈度,是否存在混浊,如结晶。

③凝胶强度测试:凝胶强度不应过硬或过软,但应牢固可用。

④成品培养基的pH值:这可能是最重要的化学测试,因为如果pH值超出培养基的建议范围,那么将可能对该培养基的一些设计生长的微生物产生抑制作用。

⑤检查损坏情况:应检查板材和瓶子是否有损坏,如裂纹和缺陷等。

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2.微生物学特性

①培养基无菌测试旨在检测制造过程中的微生物污染。选取少量(通常为批次的2%)未接种的培养基进行微生物培养。无菌测试培养所选择的温度和时间取决于培养基的类型。对于通用型培养基,温度通常为30-35°C,培养三天。所选供试品必须没有微生物生长才认为无菌测试通过。

②理论上,培养基的微生物挑战测试对于微生物实验室来说,是最重要的测试。培养基制造商进行这样的关键测试是毫无疑问的。此外,采购方通常会进行促生长测试、检查批次间的差异性或评估在运输期间发现的任何问题。

药典(USP)建议使用的菌种是必须可追溯来源的,来自于声誉良好的菌种库,如ATCC(尽管USP允许使用非常规菌种库的菌株,但其菌株等效性仍存在一些争义)。实验室应当在自己的菌种库中仔细保存这些标准菌株。这包括确保培养物保持在足够低的温度下,以避免发生表型变异,并将传代次数限制在五次以下。


欧洲药典和美国药典中的标准菌株列表:

培养基促生长试验标准菌株

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这些菌株可用于生产商评估制造的培养基是否适用于预期目的,用户也可使用这些菌株进行培养基验证。


除了标准菌株,环境分离菌株也常用于培养基测试。使用这类菌株旨在证明生产环境中的代表性微生物可以在这些特定的培养基上生长。因此,用于水系统检测的培养基需要有一个测试集,里面包含有分离自水中的微生物(如假单胞菌属等);用于环境检测的培养基,则需要包含人体皮肤上的细菌(如葡萄球菌等)。

尽管使用环境分离株越来越成为监管机构的期望,但并非所有微生物专家都支持采用环境分离株。支持使用此类分离株的理由是在培养基测试中,制药环境中分离的微生物比标准菌株更具有代表性。此外,对于环境分离株的选取,是基于对环境菌群数据的回顾而确定的,这确保了它们与制药环境的微生物负载始终具有相关性。

而反对的理由包括这样一个事实,即每个实验室都使用不同的环境菌株,将会使实验室间的评估变得困难。第二点是,一旦使用环境分离株,可能无法区分测试培养基上生长的菌是来自接种还是环境的污染。

这场辩论仍然在持续,显然需要进一步研究才能得出结果。

试验方法和验收标准



微生物挑战的数值水平是另一个重要的考虑因素。大多数测试方法要求低水平的挑战。以表明培养基可以回收少量的微生物。在大多数情况下,这一数值是小于100个微生物。

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固体培养基

可以选用各种定性和定量的测试方法。对于琼脂平皿(Agar)的试验,定性方法可以是简单的划线培养。通过划线分离得到单菌落,然后与对照平皿的菌落生长特征相比较(对照平皿一般采用之前已经验收合格的批次)。定量方法一般采用半定量划线法(ecometric method)和滴漏计数法(Miles-Misra method)。两种方法都需要将一组培养基(已经过评估的批次)与另一组培养基(待验收的批次)进行结果比较。

生态测量方法(ecometric method),是一种半定量划线法。将液体培养物通过接种环划线进行稀释。一般是每个象限划5条线,最后再划一条穿过平皿中心的线,观察所有线上的菌落生长情况。通过计算相对生长指数(RGI)来评价测试结果。RGI被定义为测试培养基和对照培养基之间的绝对生长指数(AGI)的比值。

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滴液计数法(Miles-Misra method)通过滴液方式将按梯度稀释的微生物悬浮液(10μl)的分布到培养基的各个分区中(根据稀释方案设置不同的分区数量)。培养后,根据回收的菌落数量,将试验平皿与对照平皿进行比较。该方法的准确性取决于样品的稀释度、样品中菌落形成单位的数量、样品的体积和滴液散布的技术。结果通常用生长率(Productivity Ratio)表示为对照平皿和试验平皿的比值,可接受的生长率为0.5-2.0(相当于50%-200%的回收率)

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液体培养基

对于肉汤(液体)培养基,不太容易进行定量评估。许多实验室用特定数量的微生物挑战肉汤培养基,并将随时间推移的生长情况与对照批次(已经过定性评估的批次)进行比较。挑战测试通常接种量小于100 cfu,生长时间在三到五天之间。然后比较试验批次和对照批次之间的生长情况,且两者都必须显示出大量生长的情况。此外,也有一些实验室尝试通过构建从轻微到大量增长的指标,来建立半定量方法(通常为+、++或+++)。

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实验方案


除了试验微生物的类型测试方法测试环境条件(如温度)也是一个需要考虑的问题。

许多实验室使用可在一定温度范围内使用的通用培养基,但要在每个可能使用的温度下对这种培养基进行测试,成本可能很高,并且可能会产生一个不具有实操性的放行规则。一种实用的方法是采用温度范围内的中间温度进行测试。当然,任何方案都需要经得起监管机构的审查。

培养时间是另一个需要仔细选取的参数。对于某些培养基,各国药典中有明确的规定(通常细菌3天内生长,真菌5天内生长)。而对于其他培养基,必须基于培养基的预期用途和测试用的微生物类型来确定实际的培养时间。

培养基的有效期评估


培养基需要具有规定的储存条件和有效期,并且需要验证保质期。这是为了评估不同的湿度水平(可能影响固体培养基的水活度)、化学氧化(由于温度等物理因素)和光氧化(来自阳光)是否影响培养基性能。

培养基的放行


培养基的质量控制体系需要考虑放行标准和隔离储存制度。关于放行标准,实验室必须为培养基测试评估程序制定明确的操作指南。这一指南需要涵盖无效的测试、测试中任何测试微生物未能生长的情况以及测试中达到期望的回收水平的情况。同时,为了防止未经评估的培养基进入日常使用环节,对这些培养基的存储需要与已评估的培养基隔离开,因此也需要建立相应的隔离存储制度。

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总    结

微生物培养基是药品微生物检测人员使用最广泛、最重要的工具。由此,实验室配制或者购买的培养基必须是高质量的并适合预期试验方法的。因此,对培养基的质量控制就显得尤为重要,建立适用于本实验室的培养基质量控制体系需要经过深思熟虑和充分论证。

参考文献

D.A.A. Mossel, et al. Quality control of solid culture media: a comparison of the classic and the socalled ecometric technique. J. Appl. Bacteriol. 1980; 49: 439-454.

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