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0.22μm的滤膜之下,竟然还有这些




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经常有客户来问我们,某个菌可以通过0.22μm的膜吗?可以通过0.45μm的膜吗?说实话,大多数情况下我们也不知道这些细菌是否可以通过这些滤膜,都是临时抱佛脚查查这些细菌的细胞大小,然后再根据过滤孔径,来判断是否能够通过。今天,小编打算系统来扒一扒到底有哪些神奇的微生物可以通过0.22μm和0.45μm过滤膜。

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在讲微生物之前,咱先去查了查,常见的滤膜都有哪些,都是怎么分类的。

根据滤膜的材质大致有PES(聚醚砜)、尼龙膜、PVDF(聚偏二氟乙烯)、PTFE(聚四氟乙烯)、MCE(混合纤维素)和PP(聚丙烯)聚醚砜为亲水性膜、高流速、高通量、低蛋白吸附性、低萃取性。是最佳的细胞和组织培养基滤膜。尼龙膜有良好的化学稳定性和柔韧性、耐用、极好的耐酒精性,适合过滤水溶液和大多数有机溶剂,其他的材质有一些机械强度高,有一些化学稳定性好,也分为亲水和疏水两种,可以根据实际需要进行选择。

根据滤膜孔径大小,滤膜主要分为0.8μm、0.45μm、0.22μm和0.1μm的膜0.8μm的膜可以过滤掉大颗粒的杂质,常用于样本预处理。0.45μm的膜能过滤除去大部分细菌,《中国药典》中规定了薄膜过滤法采用的滤膜孔径不大于0.45μm即可,而0.22μm的膜可以除去99.99%的细菌微生物,0.1μm的膜主要用于去除样本中的支原体。

那么问题来了,过滤除菌的滤膜为什么是0.22μm呢?

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在20世纪60年代,当时人们认为0.45μm级别的膜为“除菌级”过滤器且成功应用于注射剂的除菌过滤。而作为过滤膜除菌能力测试的标准菌为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。粘质沙雷氏菌又叫褪色沙雷氏菌,为革兰氏阴性杆菌。运动,细胞大小约0.5×(0.5~1.0) μm,能在5-40℃、pH 5-9的条件下生长。为一种人类致病菌,常常涉及医院获得性感染(HAI)。然而在一篇1960年发表的论文中,美国FDA的Frances Bowman博士发现经过0.45μm“除菌过滤的”培养基可受到一种微生物的污染,于是经过行业多年的努力,新的除菌过滤器膜应运而生,就是我们现在广泛使用的孔径为0.22μm的除菌过滤膜

那为啥定义为0.22μm呢?这是因为新的滤膜泡点值大概是0.45μm滤膜的两倍,所以孔径大约是0.45μm的一半。不过需要注意的是,滤膜孔径分为绝对精度与公称精度,0.22μm并不是特指滤芯的孔径,滤膜的工艺是复杂的,有单层膜结构,有双层膜结构,而不同的膜的制作工艺也不相同,工艺不同其孔径不可能完全相同,不同的膜过滤原理也是不同的,因此诸多不同因素的叠加很难根据膜的孔径来判断其是否达到除菌级别。目前也有报道有微生物可以通过0.22μm滤膜,遇到最多的就是Ralstonia(罗尔斯通氏菌属)

纳米级和可过滤微生物

(Nano-Sized and Filterable microorganisms)

目前已经有发现纳米级可过滤微生物,它们的细胞直径为50-400nm,可以通过0.45甚至0.22μm的滤膜,存在于海洋、河流、土壤和地下基岩等各种环境中,大部分都没有被培养和分类鉴定。

在这些纳米级可过滤微生物中,有一种情况是这些微生物起源于已知物种,由于缺乏营养或老化等内部和/或外部因素,其细胞大小随着时间的推移而缩小。例如,在低营养条件下,金黄色葡萄球菌的体积可以缩小40%,这种细胞叫作超微细胞(ultramicrocells)。

另一种情况是在任何条件下,微生物细胞均比较小,我们管这种微生物为纳米级微生物nano-sized  microorganisms)。

第三种情况是尽管微生物的细胞尺寸较大(>50-400nm),但是可以通过0.22或者0.45μm的膜,这通常是由于缺乏刚性细胞壁,使这些微生物能够有效地挤压小孔隙,通过滤膜。一般我们形容为可过滤(Filterable)。

下面的表格概述了一些纳米级和可过滤的微生物信息,包括相应的参考文献。

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微生物的适应性

在自然环境中,微生物通过其基因表达谱、生理和形态的变化,使用一系列机制来应对和适应不断变化的理化条件,所以一般来说,由于环境压力因素的影响,微生物的大小不能与标准模型相匹配在饥饿和能量限制的条件下,微生物可以急剧缩小尺寸,改变细胞形态和运动以提高生存能力,例如,Sphingomonas alaskensis(目前已经更名为Sphingopyxis alaskensis,阿拉斯加鞘氨醇盒菌),它会随着养分供应的波动而发生形态变化。在自然远洋环境中,其体尺寸很小(直径0.2 ~ 0.5 μm;长度:0.5-3 μm),但当生长在营养丰富的TSA培养基上时,它的直径和长度都增加(直径:0.8;长度:2 ~ 3 μm)。

寡营养微生物

寡养生物是一些喜欢低营养环境的生物。最典型的低营养环境之一是开阔的海洋,它包含了90%的生物圈(即所有生态系统的总和),在低营养环境下,微生物的代谢率降低,形成聚集体(即菌落)的能力减弱,例如Candidatus. Pelagibacter ubique。此外,在低营养环境下,共生细菌也倾向于缩小它们的体积,以试图增加它们的表面积与体积比。

尽管泥炭沼泽地水生系统中有机碳丰富,但由于酚类化合物浓度升高导致酸化(pH值4.4-4.8)、酶抑制和氮限制,其矿化非常缓慢。俄罗斯北部泥炭沼泽的情况就是如此,其中含有大量可过滤细菌和古细菌。对16S rRNA基因的系统发育分析表明,它们来自多个门。其中三分之一的古菌序列与MethanobacterialesMethanosarcinales的代表具有高度的同源性(94%-99%),而其余的序列与培养的产甲烷菌具有较远的亲缘性(71-74%的序列同源性)。

所有检测到的细菌物种与β-变形菌(Betaproteobacteria),γ‐变形菌(Gammaproteobacteria), α-变形菌(Alphaproteobacteria )和放线菌(Actinobacteria)具有较高的SSU rRNA基因序列一致性(94% - 99%),这证实了小尺寸是对低营养条件的适应,这在广泛的高等分类群中是常见的。

研究者还尝试在固体培养基上培养可过滤的微生物:从显微细胞总数中,只有一小部分形成了以中间根瘤菌属Mesorhizobium)、慢根瘤菌属(Bradyrhizobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和土壤杆菌属(Agrobacterium.)为代表的菌落。这些淡水样品中微生物群落的SSU rRNA扩增子文库序列与培养细菌的分类也存在很大差异

也有学者在冰川和永久冻土中分离出两种革兰氏阴性细菌,Chryseobacterium greenlandenseHerminiimonas glaciei,除此外,在其他环境中被发现的纳米级和可过滤微生物还有Oxalicibacterium solurbis、Nanobacterium sanguineumElusimicrobium minutum、Nanoarchaeum equitans、Candidatus Pelagibacter ubique、凯斯特亚菌属(Kaistia)和 金黄杆菌属(Chryseobacterium.)等。

目前,针对这些纳米级可过滤微生物的研究都集中在少数物种上,对于整个生态系统的功能暂时仍是未知,更多的纳米级可过滤微生物等着研究人员去寻找和研究,如果在过滤除菌过程中,在0.22μm孔径过滤器下有发现微生物,先别恼,这可能是一个新的发现,可以尝试鉴定或者测序来看看这究竟是什么?

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